miRNA海绵—长效抑制miRNA[创新技巧]

如何研究miRNA的功能？loss-of-function的研究当然必不可少。研究人员开发出与miRNA互补的寡核苷酸，作为mRNA结合的竞争性抑制剂。这些抑制剂实现了短期分析，在细胞培养物以及某些动物实验中都获得了成功。但是，如何实现miRNA的长期抑制？miRNA海绵应运而生……

随着研究的深入，已知miRNA的数量与日俱增，目前Sanger miRBase数据库中收录的人miRNA已达721条。不过，大部分miRNA的功能仍是未知数。在基因功能研究中，最有效的方法是阻止特定基因的功能，然后了解其后果。miRNA同样如此。

然而，相比之下，miRNA的功能研究要困难得多。为什么？首先，miRNA没有蛋白产物，这使得研究复杂化。其次，miRNA的生物发生有多个步骤。最初的转录本为pri-miRNA，它在细胞核中加工形成前体pre-miRNA。这个茎环结构的RNA输出到细胞质，被Dicer酶进一步加工，最终形成了成熟的miRNA。成熟的miRNA没有poly(A)尾巴，因而检测起来要颇费一番心思。

除了检测，miRNA的功能丧失（loss-of-function）研究也是难题。标准的RNAi技术行不通。成熟的miRNA与siRNA不相容，因为它们两者都能进入RISC复合物；pre-miRNA是茎环结构的，siRNA无从下手；pri-miRNA貌似是siRNA最容易靶定的，但一个是细胞核，一个在细胞质，好似牛郎织女，无法见面。

当然，科学家们也不是束手无策。miRNA不是能与互补的mRNA结合吗？他们就开发出与miRNA互补的寡核苷酸，作为mRNA结合的竞争性抑制剂。这些抑制剂实现了短期分析，在细胞培养物以及某些动物实验中都获得了成功。但是，如何实现miRNA的长期抑制？

2007年，麻省理工大学的Phillip Sharp及他的同事利用相似的原理，开发出一种长期抑制miRNA基因的高效方法1。他们称之为miRNA海绵（miRNA sponge），意思是吸满了miRNA，这样它就无法与天然靶点结合。miRNA海绵是一条mRNA，其3’ 非翻译区（UTR）包含若干个miRNA靶定位点（如下图）。更重要的是，这些靶定位点在RISC切割位点有一些错配。这样，抑制剂mRNA就不会被降解，而与RISC稳定结合，让它远离天然的mRNA靶点。

（图片来自Nature Methods）

经研究证实，这些miRNA海绵是高效的miRNA抑制剂，其效力与反义寡核苷酸相当。由于miRNA与靶点的相互作用是依赖种子区域（seed region，miRNA的第2-8位），这样miRNA海绵对家族中亲缘关系接近的所有miRNA都有效，即特异性不高，这也有利有弊。制备某个家族缺陷的转基因小鼠变得相当容易。但如果你想要了解某个miRNA的特定功能，那就得将与之接近的miRNA全部去除。

miRNA海绵的应用潜力无穷。它可用于靶点预测的验证，也能分析miRNA的功能丧失表型。由于miRNA海绵是由表达质粒编码的，那么它也很容易推广到其它形式，譬如慢病毒、腺病毒或转基因，适合各种不同的细胞类型。Sharp还在研究中证实，在UTR上多加几个miRNA结合位点，能增加反义序列的量，从而提高海绵的效力。从原理上来说，miRNA海绵的CMV启动子也可以换成其它组织特异的启动子，让它们在果蝇、植物等模式生物中起作用。

目前多个顶尖研究机构，例如约翰霍普金斯大学，埃默里大学的研究人员都纷纷使用miRNA海绵进行功能研究，详见《miRNA专家谈之三：如何上调或下调miRNA？》。同时，miRNA海绵的改造也在不断进行中。

美国哈佛医学院的Carlos Loya及其同事开发出果蝇miRNA海绵（miR-SP），在精确的时空分辨率下解析每个miRNA的功能2。他们利用的是基于外源DNA重组酶Cre或转录因子Gal4的表达系统，将修饰的miRNA互补寡核苷酸置于上游激活序列（UASs）的下游，实现了体内组织特异的miRNA海绵表达。miR-SP能鉴定组织特异性的miRNA功能丧失表型，确定效应器的空间调节，并了解miRNA与其他基因之间的相互作用。

研究人员发现这种构建体与Gal4的组合能表达出足够的miRNA沉默物，在完整的果蝇中实现miRNA的时空抑制。利用miR-SP系统，他们鉴定出保守的miRNA miR-8在神经肌肉结点形成上的重要作用。这项研究充分体现了miRNA海绵作为一种手段，在探索体内miRNA功能上的潜力。它还有望去除miRNA家族中种子序列相似的多个成员。

毫无疑问，miRNA海绵将会越来越红。（生物通 余亮）

参考文献：
1. Margaret S Ebert, et al. MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature Methods 4, 721 - 726 (2007)

2. Carlos M Loya, et al. Transgenic microRNA inhibition with spatiotemporal specificity in intact organisms. Nature Methods 6, 897 - 903 (2009)